میکروبیولوژی علوم تحقیقات اراک

باکتری شناسی – فصل 7 باکتریوفاژ

باکتری شناسی – فصل 7

  باکتریوفاژ

Dr Gene Mayer

Mohammad Ali Mohammadi

1-مقدمه

تعریف- باکتریوفاژها (فاژها) انگلهای درون سلولی اجباری هستند که با استفاده از بعضی و یا همه سیستم بیوسنتز میزبان، درون باکتریها تکثیر می کنند(یعنی درواقع ویروسهای آلوده کننده باکتریها).

شباهتهای زیادی بین باکتریوفاژها و ویروسهای سلولهای حیوانی وجود دارد. بنابراین، باکتریوفاژ را می توان به عنوان یک مدل برای ویروسهای سلولهای حیوانی در نظر گرفت.علاوه بر این،آگاهی از چرخه زندگی باکتریوفاژ برای درک یکی از مکانیسمهای انتقال ژنهای باکتریها ضروری است.

مدتی تصور بر این بود که استفاده از باکتریوفاژ می تواند راه موثری برای درمان عفونتهای باکتریایی باشد، اما خیلی زود مشخص شد که باکتریوفاژ سریعا" در داخل بدن از بین می رود و بنابراین ارزش بالینی کمی دارد.

با این حال، باکتریوفاژها در آزمایشگاههای تشخیصی جهت شناسایی باکتریهای بیماریزا بکار می روند(فاژ تایپینگ).با اینکه فاژ تایپینگ درآزمایشگاههای بالینی روتین کاربردی ندارد ولی در آزمایشگاههای مرجع برای اهداف اپیدمیولوژیک اهمیت دارد. اخیرا" میل زیادی به امکان استفاده از باکتریوفاژ برای درمان عفونتهای باکتریایی و پروفیلاکسی آنها بوجود آمده است.

2-ترکیب و ساختمان باکتریوفاژ

الف)ترکیب

با اینکه ممکن است باکتریوفاژهای مختلف مواد متفاوتی داشته باشند ولی همه آنها حاوی هسته و پروتئین هستند.

بسته به نوع فاژ، اسید نوکلئیک می تواندDNA و یا RNA باشد ولی نمی تواند هر دوی آنها باشد. اسید نوکلئیک فاژها اغلب حاوی بازهای غیرمعمول یا تغییریافته است. این بازهای تغییر یافته از اسید نوکلئیک فاژ در برابر نوکلئازها حفاظت می کنند که اسید نوکلئیک میزبان را در طی آلودگی به فاژ  تجزیه می کند. اندازه اسید نوکلئیک بسته به فاژ متغییر است.ساده ترین فاژها فقط تا حد کافی اسید نوکلئیک دارند که به طور متوسط 5-3 محصول ژنی  را کد کنند درحالیکه فاژهای پیچیده تر تا بیش از 100 محصول ژنی را کد می کنند.

تعداد انواع پروتئینها و میزان هرکدام از آنها در ذره فاژ به فاژ بستگی دارد. پروتئین ها در عفونت و حفاظت از اسید نوکلئیک در برابر نوکلئاز نقش دارند.

ب) ساختمان

 -باکتریوفاژ دارای اندازه ها و شکلهای مختلفی می باشد. اجزاء ساختمانی اصلی باکتریوفاژ در شکل 1 نشان داده شده، که فاژT4 را نشان می دهد.

 

1-اندازه- T4 جزو بزرگترین فاژهاست. این فاژ حدودا" 200 نانومتر طول و 100-80 نانومتر عرض دارد.فاژهای دیگر کوچکتر هستند.اکثر فاژها اندازه ای بین 200-24 نانومتر دارند.

 

2-سر یا کپسید –همه فاژها حاوی ساختار سر هستند که شکل و اندازه متفاوتی دارد.بعضی ایکوزاهدرال هستند و بعضی دیگر رشته ای.

 

کپسید متشکل از تعداد زیادی کپی از یک یا چند نوع پروتئین است. درون کپسید،نوکلئیک اسید وجود دارد.کپسید به عنوان پوشش محافظ نوکلئیک اسید عمل می کند.

 

3-دم-بیشتر فاژها(نه همه آنها) دارای دم متصل به کپسید هستند.دم یک لوله تو خالی است که اسید نوکلئیک در طی عفونت از آن عبور می کند.اندازه دم  می تواند متغییر باشد و بعضی فاژها حتی دم ندارند.

در فاژهای پیچیده تر مثل T4، دم توسط صفحه انقباضی احاطه شده که در طی آلودگی باکتری منقبض می شود.در انتهای دم فاژهای پیچیده تر یک صفحه بازال و یک یا چند رشته متصل به آن وجود دارد.  صفحه بازال و رشته های متصل به آن در اتصال فاژ به سلول باکتری نقش دارد.

 

3-آلودگی سلول میزبان

الف) جذب

اولین مرحله فرایند عفونت، جذب فاژ توسط سلول باکتری است. این مرحله بواسطه رشته های دم انتهایی فاژ و یا بعضی ساختارهای معادل آن در فاژهایی که فاقد این رشته ها هستند صورت می گیرد که به شکل برگشت پذیر می باشد.

به  رسپتورهایی درسطح سلول باکتری متصل شده و اختصاصی بودن میزبان برای فاژ (یعنی باکتری که قادر به آلوده شدن به فاژ است) معمولا" بستگی به نوع رشته های دم انتهایی فاژ دارد. رشته های دم انتهایی فاژ

نوع رسپتور فاژ نیز بسته به نوع باکتری متفاوت است. مثلا"  پروتئین های سطح خارجی باکتری،LPS، پیلای لیپو پروتئین  جزو این رسپتورها هستند. این رسپتورها در سطح باکتریها برای اهداف دیگری وجود دارند و فاژها طوری تکامل پیدا کرده اند تا از این رسپتورها برای آلوده کردن باکتریها استفاده کنند.

ب) اتصال غیر قابل برگشت

اتصال فاژ به باکتری از طریق رشته های دم انتهایی فاژ، اتصال ضعیف و برگشت پذیری است. اتصال غیر قابل برگشت فاژ به باکتری بواسطه یک یا چند جزء صفحه بازال صورت می گیرد.فاژهایی که فاقد این صفحه هستند از راههای دیگری برای اتصال محکم به سلول باکتری استفاده می کنند

ج) انقباض صفحه

اتصال غیر قابل برگشت فاژ به باکتری منجر به انقباض غلاف می شود(در فاژهایی که غلاف پوششی دارند) و رشته تو خالی فیبر به سمت پوشش باکتری جلو برده می شود(شکل2). فاژهایی که فاقد پوشش انقباضی هستند از مکانیسمهای دیگری برای عبور ذره فاژ از پوشش باکتری استفاده می کنند. بعضی فاژها دارای آنزیمهایی هستند که اجزاء مختلف پوشش باکتریها را هضم می کنند.

د) تزریق اسید نوکلئیک-

وقتی فاژ از پوشش باکتری عبور کرده،اسید نوکلئیک آن از قسمت سر از دم توخالی فاژ عبور کرده و وارد سلول باکتری می شود.

 معمولا" تنها جزء فاژ که واقعا" وارد سلول باکتری می شود اسید نوکلئیک است. باقیمانده فاژ در خارج از باکتری باقی می ماند که البته این حالت چند استثناء دارد.  در حالیکه در اکثر ویروسهای سلول حیوانی، معمولا" ذره ویروس وارد سلول می شود.این تفاوت احتمالا" به دلیل توانایی باکتریها در فراگرفتن مواد مختلف است.

4- چرخه تکثیر فاژ

الف) فاژهای لایتیک یا ویرولانت

1.تعریف

فاژهای لایتیک یا ویرولانت، فاژهایی هستند که فقط می توانند در باکتریها تکثیر کرده و آنها را بوسیله لیز در مرحله پایانی چرخه زندگی شان بکشند.

2-چرخه زندگی

چرخه زندگی یک فاژ لایتیک در شکل 3 نشان داده شده است.

 

دوره پنهان شدن فاژ

در طی این دوره، هیچ ذره فاژی عفونی در داخل یا خارج باکتری یافت نمی شود.اسید نوکلئیک فاژ ،کنترل ماشین بیوسنتز سلول میزبان را در دست می گیرد و mRNA وپروتئینهای اختصاصی فاژ تولید می شود.

سپس بیان ماکرومولکولها با هدایت فاژ  به همان شکلی که در مورد ویروسهای حیوانی رخ می دهد، صورت می گیرد. mRNA اولیه برای پروتئینهای اولیه کد می شود که جهت سنتز DNA فاژ مورد و غیر فعال کردن سیستم بیوسنتز DNA،RNA و پروتئینهای میزبان نیاز هستند. در بعضی موارد، پروتئینهای اولیه در واقع کروموزوم میزبان را تجزیه می کنند.پس از سنتز DNA فاژ، mRNA و پروتئینهای تاخیری تولید می شوند.

پروتئینهای تاخیری، پروتئینهای ساختمانی هستند که در فاژ وجود دارند از جمله پروتئینهای مورد نیاز جهت لیز سلول باکتری.

 

فاز انباشتگی درون سلولی

در این مرحله، اسید نوکلئیک و پروتئینهای ساختمانی فاژ که تولید شده اند سر هم شده و ذرات عفونی فاژ درون باکتری تجمع پیدا می کنند.

فاز لیز و رها شدن

پس از مدتی باکتری به علت انباشته شدن پروتئین لیز کننده فاژی در داخل آن شروع به لیز شدن می کند و فاژهای داخل سلول باکتری به محیط آزاد می شوند.تعداد فاژهای آزاد شده از هر باکتری آلوده شده حتی ممکن است به  .1000 عدد هم برسد

 

3- سنجش فاژ لایتیک

سنجش پلاک

فاژهای لایتیک بوسیله سنجش پلاک شمارش می شوند. پلاک در واقع ناحیه روشنی است که در نتیجه لیز باکتری ایجاد می شود(شکل4). هر پلاک از یک ذره فاژی عفونی ناشی می شود.ذره عفونی که موجب تشکیل پلاک می شود یک واحد تشکیل دهنده پلاک

فاژ لیزوژنیک یا معتدل

1-تعریف

فاژهای لیزوژنیک یا معتدل فاژهایی هستند که هم می توانند از طریق چرخه لایتیک تکثیر پیدا کنند و هم اینکه وارد یک مرحله خاموش درون سلول شوند. در این مرحله، اکثر ژنهای فاژ رونویسی نمی شوند و ژنوم فاژ در حالت مهار شده قرار دارد.

DNA فاژ در این مرحله پروفاژ نام دارد زیرا این ذره یک فاژ نیست ولی پتانسیل تولید فاژ را دارد. در اغلب موارد، DNA فاژ به کروموزوم میزبان ملحق می شود و همراه با آن تکثیر می شود و به سلولهای دختری منتقل می شود. سلول حاوی پروفاژ تحت تاثیر حضور پروفاژ قرار نمی گیرند و مرحله لیزوژنی ممکن است مدت نامعلومی باقی بماند. سلول حاوی پروفاژ، لیزوژن نامیده می شود.

2- وقایعی که منتهی به لیزوژنی می شوند- فاژ نمونه: لامبدا

حلقوی شدن کروموزوم فاژ

 DNA فاژ لامبدا یک مولکول دورشته ای خطی است که دارای نواحی تک رشته کوچک در انتهای   5'می باشد.این انتهاهای تک رشته (انتهای چسبنده) مکمل هستند، بنابراین می توانند با بزها جفت شوند و یک مولکول حلقوی ایجاد کنند. در  سلول، انتهاهای آزاد می توانند به هم متصل شده و یک مولکول حلقوی را ایجاد کنند که در شکل 5 نشان داده شده.

 

نوترکیبی در جایگاه اختصاصی

فرایند نوترکیبی بوسیله آنزیمی که توسط فاژ کد می شود کاتالیز می شود و نوترکیبی بین یک جایگاه خاص روی  DNA حلقوی فاژ و جایگاه خاصی روی کروموزوم میزبان صورت می گیرد. در نتیجه، ژنوم فاژ به کروموزوم باکتری ملحق می شود که در شکل 6 نشان داده شده است.

سرکوب ژنوم فاژ

پروتئین فاژِ به نام سرکوبگر(رپرسور)  تولید می شود که به محل خاصی روی DNA فاژ به نام اپراتور متصل می شود و رونویسی اکثر ژنهای فاژی به استثنای ژن رپرسور را متوقف می کند.

در نتیجه یک ژنوم فاژی سرکوب شده پایدار ایجاد می شود که به کروموزوم میزبان ملحق می شود.

هر فاژ معتدل فقط DNA خودش را سرکوب می کند نه دیگر فاژها، بنابراین سرکوب یک عمل بسیار اختصاصی است.

3- وقایعی که منجر به پایان لیزوژنی می شوند:

هر زمانی که یک باکتری لیزوژن در معرض شرایط نامناسب قرار بگیرد،وضعیت لیزوژنی پایان می یابد.این فرایند القاء نامیده می شود. شرایطی که موجب پایان مرحله لیزوژنی می شوند عبارتند از: قرار گرفتن در معرض تابش UV و یا تابشهای یونیزان، مواد شیمیایی موتاژن و ...

شرایط نامساعد منجر به تولید پروتئازها (پروتئین recA) می شود که پروتئین رپرسور را تخریب می کند.این عمل منجر به بیان ژنهای فاژ، معکوس شدن فرایند الحاق و تکثیر لایتیک می شود.

4-چرخه لایتیک در برابر لیزوژنیک

تصمیم فاژ لامبدا برای ورود به چرخه لیزوژنیک یا لایتیک در زمان ورود به سلول توسط غلظت پروتئین رپرسور و پروتئین فاژی دیگری به نام cro در سلول تعیین می شود.

پروتئین cro سنتز رپرسور را متوقف می کند،بنابراین مانع ایجاد فاز لیزوژنی می شود.شرایط محیطی که موجب ایجاد این پروتئین می شوند منجر به ایجاد چرخه لایتیک و شرایطی که موجب ایجاد پروتئین رپرسور می شوند منجر به ایجاد چرخه لیزوژنی می شود.

 

5-اهمیت لیزوژنی

الف) مدل برای ترانسفورمیشن ویروس حیوانی

ب) تبدیل لیزوژنی

وقتی یک سلول لیزوژن می شود، به ندرت ژنهای اضافی که توسط فاژ حمل می شوند در سلول بیان می شوند.این ژنها می توانند خصوصیات سلول باکتری را تغییر دهند.این فرایند، تبدیل لیزوژنی نامیده می شود که از نظر بالینی حائز اهمیت است.مثلا" فاژهای لیزوژنی وجود دارند که حامل ژنهایی هستند که آنتی ژن O سالمونلا  را تغییر می دهند که یکی از آنتی ژنهای اصلی باکتری برای هدایت پاسخ ایمنی است.

تولید توکسین توسط کورینه باکتریوم دیفتریه بواسطه ژنی است که یک فاژ آنرا حمل می کندو تنها سویه هایی که توسط لیزوژنی تغییر پیدا کرده اند بیماریزا هستند.